蛋白质聚集问题分析及策略
浏览次数：34 日期：2023-08-25 16:40:40
蛋白质聚集是近年来才公布的一个生物物理学名词，指错折叠的蛋白质分子间通过疏水作用形成非晶态聚合物的过程。是蛋白类药物研发和商业化过程中一个重要的挑战之一。
聚集体在蛋白质产品开发和生产过程的所有阶段都可以观察到，如蛋白表达、纯化、保存等。蛋白质聚集不仅会导致蛋白质在生产过程中收获率的降低，还会对蛋白质功能产生影响。在蛋白质的生产、运输和储存过程中引起蛋白质发生聚集的因素有很多，如热诱导、光胁迫、氧诱导、剪切诱导、表面活性剂、抑制剂、pH、金属离子、离子强度、表面电荷、二硫键、蛋白质浓度、蛋白质疏水性、蛋白质结构域、蛋白质残基、蛋白质糖基化和磷酸化等。因此，了解蛋白质聚集的途径和影响因素对控制蛋白质聚集就显得十分必要了。
蛋白质聚集途径分析
不同的因素以不同的作用形式和途径对蛋白质的聚集产生影响。例如以下情况：
① 热诱导和蛋白质浓度分别通过改变共价键的结合和静电作用力形式，从而导致蛋白质聚集倾向增加；
② pH的变化会改变蛋白质分子中酸、碱性氨基酸的解离程度，影响氢键、离子键的形成和稳定，从而导致蛋白质展开或部分展开促进蛋白质的聚集；
③ 蛋白质中的游离的硫醇基很容易形成共价键结合的二聚体，而且蛋白质中的半胱氨酸残基对以共价键形式的蛋白质聚集也十分普遍；
④ 一级结构中氨基酸的突变会对其聚集产生影响。如在胰岛素二聚体的疏水腔中有一个苯丙氨酸残基，该残基被甘氨酸或丙氨酸取代产生的胰岛素二聚体稳定性明显降低；
⑤ 另外具有较高翻译特点的蛋白质因其容易发生未折叠蛋白质反应导致聚集。
不同的因素能够引起蛋白质聚集且聚集方式存在不同，也会导致聚集途径中不同结构的中间体出现。而且同一种蛋白也会以共价键和非共价键两种形式的聚集体同时存在。对于已有蛋白质的聚集，常常是添加稳定剂。最常用到的稳定剂包括表面活性剂、烷基糖类、氨基酸衍生物等。一些表面活性剂，如甘油，可以通过抑制蛋白质展开和稳定部分展开中间体来阻止蛋白质的聚集，也可以通过潜在地减少蛋白质自结合、吸附、蛋白与其他易聚集物质的相互作用来减少蛋白质的聚集。糖类是另一种常用的蛋白质稳定剂，其主要通过增强构象稳定性来减少蛋白质的聚集倾向。除此之外，多元醇、氨基酸、聚胺等也被证明可以减少蛋白质聚集。一些氨基酸和其它一些有机物也被用作抑制剂来抑制蛋白质的聚集，如精氨酸、聚精氨酸及其类似物聚鸟氨酸、L-脯氨酸、L-异亮氨酸、维生素K3等，其中以精氨酸最为常用，其主要被认为是通过静电相互作用、疏水相互作用、阳离子-π相互作用等降低蛋白质表面疏水性而使蛋白质稳定，从而减少聚集。
蛋白质聚集控制策略
① 蛋白质结构和修饰的改造
关于蛋白质结构影响聚集的研究中，通过改变蛋白质结合区域的凹面表面静电势可以增强蛋白质的抗聚集能力。通过氨基酸定点突变改变蛋白质表面正电荷，从而提高蛋白质的溶解度，减缓蛋白质因浓度依赖的聚集，通过模拟氨基酸定点突变改变该蛋白质的表面电势，降低该蛋白质间因静电作用产生聚集体；另有糖基化修饰不完整的糖链容易导致该蛋白质的聚集，而且在浓缩的过程中更容易产生聚体。可以通过对剪切应力、温度和保护剂浓度进行条件优化以减少聚集；另外蛋白质糖基化修饰可以减少暴露的蛋白质疏水区域、展开发生的概率以及降低对氧的敏感性。除了蛋白质糖基化修饰以外，也有研究表明二聚体蛋白质表面磷酸化也会减低二聚体的稳定性。因此，基于结构设计一种特殊的肽可以和蛋白质的聚集性部分折叠中间体进行结合，以抑制蛋白质早期聚集成核阶段。研究发现聚脯氨酸-精氨酸(poly-PR)和聚甘氨酸-精氨酸( poly-GR)的二肽重复序列，因为亲水的精氨酸残基的存在而相对不利于蛋白质形成聚体。因此也可以尝试蛋白质中设计上述二肽重复序列以减少蛋白质聚集。
② 蛋白质制备过程控制
在细胞培养过程中，细胞死亡后，内源性糖苷酶释放到培养基中可能会使培养基中的糖蛋白发生去糖基化，促使培养基中的蛋白质形成二聚体或多聚体。可以通过添加糖苷酶的抑制剂或者采用灌流培养的方式减少糖苷酶的浓度；在培养基中，添加CuSO4可使游离醇含量降低，促进二硫键的生成，减少以共价键形成的蛋白质聚体；蛋白浓缩时超滤所产生的浓差极化现象和透析时所产生的唐南效应导也可能出现聚集，解决上述问题可以通过替换具有不同结构的超滤膜以及添加表面活性剂来减少蛋白质颗粒的形成；添加高浓度的组氨酸可以屏蔽蛋白质表面电荷，减少远程和短程静电力以抑制聚集；如果蛋白质聚集不能通过控制配方来实现，则冻干是可以选择的另一种方法。
③ 蛋白质保存及运输过程控制
蛋白质稳定性强烈地依赖于溶液条件。其中一个关键条件是溶液pH，其可以影响蛋白质的构象和胶体稳定性，进而影响蛋白质的聚集。改变溶液的pH可以改变蛋白-蛋白相互作用的性质和程度、蛋白质聚集体的溶解性、以及成核和聚集体生长的速率。在一项关于稳定促红细胞生成素的研究中，使用甘氨酸、谷氨酸和吐温20组合降低了其产生聚集和降解。因此可以添加不同的中性、酸性、碱性氨基酸组合以稳定对环境胁迫较敏感的蛋白质聚集以及保持蛋白质的活性；在冻融胁迫条件下，可以使用甜菜碱稳定并抑制蛋白质的聚集，但是这种抑制一般在低浓度蛋白质下发挥作用；在运输保存的过程中，为提高蛋白质产品的储存时间，有时会需要添加抗菌防腐剂，需要注意的是有些防腐剂也被证明可以导致蛋白质局部结构失稳引起聚集。对于一些蛋白质二聚体，适当浓度的乙醇溶液有一定的抑制效果，如胰岛素二聚体解离，因为乙醇作为一种两亲性溶剂可以和蛋白质分子的疏水残基和极性残基发生显著作用，从而改变表面自由能，增加聚体解离概率。
此外，也有一些抑制蛋白质聚集的添加剂被报告，如一种半胱氨酸反应小分子“依布硒”能够有效地促进含有二硫键的形成从而减少共价键形成的聚集体；乙二醛能对蛋白质进行修饰，起到了稳定蛋白质构象作用；化学伴侣4-苯基丁酸可以剂量依赖性地缓解蛋白质的聚集；两性离子聚合物基核壳纳米凝胶抑可以制由热诱导引起的蛋白质聚集来保护蛋白质的高级结构。总之，蛋白质的稳定大体相似，而蛋白质的聚集各有各的不同，本文仅对聚集的途径以及尝试的策略做一些分享。
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