小分子抗原合成人工抗原的方法及案例
浏览次数：20 日期：2023-10-07 11:39:20
小分子抗原指的是分子量较小的化合物，通常指的是分子量小于1000的有机化合物。小分子抗原抗体制备的基本原理是通过免疫原性小分子抗原与免疫系统相互作用，诱导机体产生相应的抗体。这些抗体可以特异性地识别并结合目标小分子抗原，从而实现对该小分子抗原的检测、分离和纯化。说到小分子抗原，不得不提另一个概念，半抗原，又称不完全抗原，是指某些单独存在时不能诱导免疫应答，即不具备免疫原性，但当与大分子蛋白质或非抗原性的多聚赖氨酸等载体交联或结合(通常是以共价键的形式进行结合)后可获得免疫原性，从而诱导免疫应答的小分子物质。半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性，因此它是只有免疫反应性(抗原性)。小分子化合物抗原是最典型的半抗原，常见的半抗原有多糖、类脂、核酸和某些小分子化合物和药物等。
④ 混合酸酐法
半抗原的设计
半抗原是指具有反应原性，但不具备免疫原性，能与对应抗体结合出现抗原-抗体反应又不能单独激发人或动物产生抗体。半抗原的设计与选择取决于待测物的分子结构，如果待测物本身具有—COOH、—NH2、—OH 和—SH等活性基团，可直接通过交联剂与载体偶联，无需对药物结构进行改变即可以作为半抗原使用。若待测物本身没有可直接与载体共价连接的活性基团，或者虽然具有活性基团但这些基团对维系待测物的免疫特性十分重要而不能用作与载体偶联时，则必须根据免疫学理论并结合该待测物的自身结构进行半抗原的重新设计。应注意的是: 首先半抗原的设计中应尽量保留待测物的特征基团，以保证获得的抗体能够与待测物发生特异性免疫反应，必要的时候还需要对这些基团进行保护；其次半抗原的结构还应具有一定的复杂性，如含有苯环、杂环和支链等高免疫活性的基团，近年来也有研究显示在待测物上连接二肽基团可增强半抗原的免疫活性。
在半抗原的合成过程中，为了保留待测物特征结构、突出待测物的免疫活性结构的同时在适当位置引入合适的活性基团，或者待测物自身具有多个相同基团时，需要对不与载体进行耦联的基团进行保护。如常用叔丁基、苄基和硅烷基等与羟基生成醚或酯来保护羟基。例如多拉菌素( DOR) 结构较为复杂，含有3个羟基: C4'—OH、C5—OH 和 C7—OH。由于7位C上羟基具有高位阻效应，难以进行反应，而如果选择C5—OH，突出的是DOR的双糖部分，是非免疫活性部位，因此选择C4″—OH 作为其半抗原合成的反应基团，同时也就需要对C5—OH进行保护。以叔丁基二甲基氯硅烷( t-BuMe2 Si-Cl) 与多拉菌素的C5—OH 结合形成叔丁二甲硅醚，避免其参与4位C上羟基与琥珀酰酐( C4H6O4 ) 的反应，并以对苯磺甲酸( C7H8O3 S) 将保护基脱去，得到半抗原4″-O—单琥珀酰DOR。
人工抗原的构成
人工抗原由半抗原、载体、偶联臂三部分构成。合成时根据半抗原分子上的基团选择适当的试剂，将其与载体结合。一般来说，合成试剂作为偶联臂链接半抗原与载体，也有的是半抗原分子与载体直接结合，即偶联臂为半抗原分子的一部分。载体作为其中重要的组成部分，应具备以下特点：
（1）表面应具有化学活性基团，可以直接与小分子耦联，这是化学耦联制备抗原的前提；
（2）具备一定的容量，可以耦联足够的分子；
（3）应该是惰性的，不应干扰耦联分子的功能；
（4）具有足够的稳定性，且应廉价易得。
用作耦联载体的有蛋白质类、多肽聚合物、大分子聚合物和某些颗粒，载体的选择要考虑免疫原性、溶解性及来源、相对分子质量、价格、活性基团能否与小分子形成合适的耦联等因素。一般认为，用于免疫动物亲缘关系较远的蛋白作为载体有利于诱导较强的免疫应答。
常用作合成人工抗原的载体蛋白质有牛血清白蛋白( BSA)、鸡卵清蛋白( OVA)、人血清蛋白( HSA)、兔血清蛋白(RSA)、钥孔血蓝蛋白( KLH)以及人工合成的多聚赖氨酸( PLL) ，这些通常为亲水性载体。目前，使用最多的是牛血清白蛋白，因其有较大的反应基团如－COOH、－NH2，且性质稳定、不易变性、廉价易得，能在水相或一些有机溶剂混合物中溶解。
人工抗原合成方法
人工抗原的合成方法有很多，含羧基(－COOH)的半抗原一般采用碳二亚胺法、混合酸酐法、N－羟基丁二酰亚胺活性酯法等；含氨基(－NH2)一般用戊二醛法、卤代硝基苯法、二异氰酸酯法、重氮化法等；含羟基(－OH)一般可用琥珀酸酐法、光气法、卤代羧酸法等；含有巯基(－SH)、醛(－CHO)、酮(－CO－)结构的半抗原亦可利用相应的双功能团试剂，如N-羟基琥珀酰亚胺基-3-( 2-吡啶基二硫) -丙酸酯( SPDP)、N-羟基琥珀酰亚胺-4-(对马来酰亚胺基) -苯丁酸酯( SMPB)与蛋白偶联。下面列举比较常用的方法及应用。
① 碳二亚胺法
碳二亚胺（EDC）使羟基和氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的羧基先与EDC反应生成一个中间体，然后再与蛋白质上的氨基反应，形成半抗原与蛋白质的结合物。EDC作为酰胺键的形成介质并没有形成手臂分子，因此被称作零长度交联剂。此连接方法十分简便，只需将载体蛋白质和抗原按一定比例混合在适当的溶液中，然后加入水溶性EDC，搅拌1～2 h，置室温24 h，再经透析即可。因此，此法在含羧基的人工抗原的合成中应用最广泛。如果半抗原分子中不含羧基，可通过某些化学反应引入羧基后用此法进行耦联。此方法合成的案例有叶酸、甲氨蝶呤等，原理图如下：
② 活泼酯法
活泼酯法是对EDC法的改进，对于含有羧基的半抗原或药物，为减少蛋白分子间的自身聚合，可以先将药物分子上的羧基转化为N-羟基琥珀酰亚胺基（NHS）的活泼酯，然后再与抗体交联。含有羧基的半抗原或药物在二环己基碳二亚胺（DCC）的作用下，与NHS反应，生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白上的氨基反应，形成以酰胺键连接的耦合物，以硼氢化钠还原后即可得到稳定的以碳-氮单键连接的结合物，反应过程中无需分离中间产物。由于该法避免了EDC对蛋白的直接作用，从而避免了蛋白分子间的交联。此方法合成的案例有甘胆酸、氧氟沙星等，原理图如下：
③ 戊二醛法
化学偶联试剂中有一类在偶联之后具有稳定偶联桥，一般情况下是不可切断的，这类试剂中典型例子是戊二醛。它具有两个反应性活性醛基, 可与蛋白质分子中氨基酸残基侧链上ω-氨基发生作用，从而形成偶联。戊二醛法是最为温和的偶联反应之一，可在pH 6.0～8.0的缓冲溶液中进行，温度范围一般控制在4～40℃。这种方法与碳二亚胺法类似，也易造成载体间的偶联，产物均一性差。该法多用于酶标抗体的制备。此方法合成的案例有卡那霉素、磺胺对甲氧嘧啶等，原理图如下：
④ 混合酸酐法
混合酸酐法反应过程简单，也无需制备和分离中间产物，但其操作较为复杂，控制条件比较严格，且混合酸酐法中需加入氯甲酸异丁酯溶剂，该溶剂有剧毒。羧基可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，生成活泼中间体混合酸酐，然后与蛋白载体上的伯氨基反应，形成酰胺交联键。此方法合成的案例有睾酮、呋喃唑酮等，原理图如下：
本公司还有其它很多成功的方法及案例就不一一列举了，对于人工抗原的合成技术也在不断发展，相信在这一领域具有广泛的应用前景。尽管合成方法有了很大的发展，但能否合成稳定的具有良好免疫原性的人工抗原是制备抗体和建立免疫分析方法的最关键的步骤，而半抗原的设计和合成又是合成人工抗原的前提和基础。面对一个新的、具体的待测物时，由于免疫应答具有其复杂性，其人工抗原的合成要根据自身结构特征具体分析与对待，需要设计、组合出多套方案，如从不同位置引入不同性质的基团、不同长度的间隔臂，将半抗原与多种载体相结合，通过改变投料比例获得不同结合比的人工抗原等。通过免疫活性测试，优化筛选制备方案。因此，人工抗原合成研究不单纯是化学合成问题，亦涉及免疫学原理，如何根据免疫学原理合成具有较高免疫原性的人工抗原是该领域的重要研究方向。
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