无缝克隆试剂盒，让载体构建更轻松！
浏览次数：107 日期：2023-06-02 10:58:05
提起“载体构建”，大家可能最先想到的是酶切酶连法，即使用限制性内切酶切割产生黏性末端，再使用T4 DNA 连接酶连接片段。该方法连接时间长、操作繁琐、阳性率低。相信每个做过分子实验的人可能都会有这样的经历：经过多次的 PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？？？前前后后做几天还没几个阳性克隆，一不小心从头开始。。。
今天就给大家详解可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。
华美·科赛格不仅可以为客户提供相关分子生物学产品，并且能够根据客户需求依托公司深厚的技术积累和研发创新实力，为客户提供个性化定制开发和针对性的系统解决方案，以客户为中心，全力满足客户需求。
今天就给大家详解可以一步法快速构建同源重组载体，并且阳性率很高的方式：无缝克隆。
无缝克隆技术是一种新的、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标 DNA 的片断的插入，而不需要任何限制性内切酶。突破传统的双酶切再加上连接，只需要一步重组法，即可得到高效率克隆的重组载体，大大提高了工作效率。
无缝克隆原理
无缝克隆原理
操作步骤
无缝克隆实验的主要操作可以分为3个步骤：
1. 获取线性化载体
①酶切法：在目的载体上选取合适的酶切位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的质粒进行胶回收纯化；
②反向PCR法：在插入位点的两侧设计一对方向相反的引物对目的载体进行扩增，通过胶回收获取线性化的质粒片段。
2. 通过PCR获取插入片段
在引物5’端引入同源序列，使扩增产物与线性化载体之间具有完全一致的序列（15-25 bp）。
3. 无缝克隆反应
将线性化载体、插入片段以及无缝克隆反应液按比例混合，恒温反应5-60 min。
通过以上三步，就可以完成质粒重组。只要再进行后续的转化感受态、菌落PCR等操作，就可以获得阳性克隆。
无缝克隆试剂盒产品特点
位点选择灵活：载体任意位置基因克隆；
快速简便：一小时内可以完成载体构建；
克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；
一次进行多片段目的基因的重组。
实验结果
图1.无缝克隆试剂盒克隆不同长度的的单片段基因
图2.无缝克隆试剂盒不同孵育时间，克隆效果相同
订购信息
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