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免疫层析技术是华美科赛格IVD原料验证的核心技术之一。它的基本检测原理是将抗原或者抗体标记到胶体金或荧光微球上，同时将抗原或者抗体固定到硝酸纤维素膜上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后, 通过毛细作用向前移动, 溶解标记物垫上的已经标记过的抗原或抗体后相互反应, 再移动至固定了抗原或抗体的区域时发生特异性结合而被截留, 聚集在检测带上，通过胶体金或荧光微球的信号检测实现特异性的免疫分析。
 

荧光免疫层析中微球标记抗体对最终试剂性能有着重要的影响，今天小编就为大家分享下微球标记方面的内容，希望对各位老师的研发工作有所帮助。

 

目前市面上微球大小一般为100-400nm，其中微球的粒径越小，线性越长，粒径越大，灵敏度越高。当然不同厂家粒径相近也存在灵敏度不同，可能跟每家的表面羧基含量不同或者工艺不同有关。

 

研发人员都是希望尽可能减少抗体的投入量以节省成本。一般来说粒径在150nm以下的微球，初始抗体投入量可以是200ug/mg，粒径在150nm以上的微球初始投入100ug/mg，通过梯度验证，确定最终抗体投入量。

 

一步法中，微球活化后加入蛋白时未移除多余的EDC。优点是反应步骤和时间缩短，缺点是可能不是蛋白质的最佳偶联条件，从而导致偶联效率变低；由于多余EDC的存在，有些蛋白对此敏感，容易引起失活或者标记失败。

两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。排除其对抗体活性的可能影响，也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面、加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。缺点是反应步骤繁多和时间比较长。

 

微球标记包含4大步骤，分别为：活化-偶联-封闭-复溶保存，对于活化前后是否对微球清洗，各位老师可以根据自己项目进行选择。标记环节中活化、偶联和封闭是免疫标记的重要环节。以下我们会介绍微球在免疫标记中活化、偶联和封闭实验过程中的一些注意事项。

 

微球常用的活化剂有EDC和NHS。EDC是极易溶于水的碳二亚胺，在酰胺合成中，用作羧基的活化试剂，使用时的PH范围一般为4.0-6.0，常和NHS连用，以提高偶联效率。在活化微球上的羧基时，微球跟活化剂的质量比，EDC跟NHS的质量比都有一个合适的比例，过少会导致活化不充分，偶联效率低，最终降低灵敏度；过高会导致微球聚集发生形态改变，也会降低偶联效率。

EDC的活化浓度与微球的表面羧基含量相关，应根据微球厂商提供的表面羧基含量计算EDC和NHS的合适反应浓度，一般按照微球表面羧基含量的1.2~1.5倍EDC用量即可。不足量的EDC易导致羧基不能充分活化，反之，过量的EDC和NHS较难在后续步骤中清洗干净，进而可能影响偶联反应。

 

在同样的体系下，用微球标记不同的抗体，有些抗体会出现聚沉，导致该现象发生的主要原因是不同抗体的等电点存在差异。当体系的PH不合适该抗体会导致电荷分布不均匀，从而产生不同程度的聚沉现象，因此偶联不同的抗体时，可以尝试对体系的PH做出调整，从而找到该抗体适合的PH。当然标记浓度、偶联时间、温度对标记效果也有着很大的影响。

 

微球与抗体通过共价键结合，然而微球上未结合抗体的表面仍然有吸附其他蛋白的能力，会干扰后续特异性反应。牛血清白蛋白普遍被认为是非常好的封闭剂，也可用脱脂奶粉、Casein、乙醇胺、明胶等替代。

 

D-二聚体(D- Dimer)是纤溶酶作用于交联蛋白的特异性分子标志物。它含有两个相同的亚基，每个亚基都由α、β和γ三个多肽链组成，就是通常所说的“D-二聚体”,D-二聚体检测在排除深静脉血栓栓塞症(DVT)和肺栓塞(PE),有着广泛的应用。另外D-二聚体出现在继发性纤溶中，对其他血栓形成性疾病如弥漫性血管内凝血(DIC)、脑血管疾病、肝脏疾病及恶性肿瘤等疾病均有重要的诊断价值。同时D-二聚体检测还可用于溶栓药物的治疗监测指标。

 

华美科赛格D-二聚体（D- Dimer）单抗产品在荧光免疫层析平台测评，将本公司的自产抗体制成试剂检测34例希森美康赋值样本（浓度范围：0.16-31.15 ug/ml），两者相关性高达0.98，说明本公司自产单抗适用于荧光层析平台。

 

宿主动物：Balb/c小鼠

融合细胞系：Sp2/0

抗原：D-二聚体

纯度：经SDS-PAGE检测，纯度>90%

提纯方法：蛋白A亲和层析

物理状态：溶于PBS，0.22 μm过滤，含微量叠氮钠

货号：CSB-DA220HmN③ - CSB-DA220HmN④

比对试剂：希森美康

相关性：＞0.98

 

 

 

 

 

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