一文读懂RNA酶抑制剂
浏览次数：178 日期：2023-08-25 16:21:52
RNA酶（RNase)是水解RNA的核酸内切酶，主要切断核苷酸之间的磷酸二酯键。RNA酶分子非常稳定，结构中存在二硫键，其活性不需要二价阳离子存在，因此RNA酶不容易变性，即使高温或使用变性剂后也容易发生复性。RNA酶分为内源性和外源性，其中内源性RNA酶在细胞破裂时可同时释放出来，因此消除内源性RNA酶的作用是RNA提取过程中非常关键的一个步骤。外源性RNA酶分布则非常广泛，空气、人的皮肤、头发和唾液等都存在RNA酶，是造成RNA容易降解的重要原因。
作用原理
目前呼吸道病原核酸检测主要的样本类型是咽拭子，常用的样本保存液多种多样，都需要冷藏或冷冻运输储存；因RNA样本的理化性质及RNA酶等的存在，样本RNA容易降解，采集转运过程中全程低温控制较难，样本检测前质量控制较难保证。CANS-CL02-A009《医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明》在技术要求里，提出应根据用途，制定适宜的水质标准；检验前过程使用无 DNase和/或无RNase的一次性密闭容器。
RNA酶抑制剂
RNA酶抑制剂具有广谱的RNA酶抑制作用，包括中性的真核生物的RNA的抑制作用。RNA酶抑制剂与RNA酶结合的有效浓度时10-14M。而且，RNA酶抑制剂的动力学结合是非常迅速的，确保与RNA酶的迅速络合，并对其产生迅速的抑制作用。
分类与作用
作用原理
异硫氰酸胍：目前认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活，它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。
RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胚盘中提取得来的酸性糖蛋白.Rnasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
高温：高温也是蛋白变性的常用手段。
焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，他通过和RNA酶的活性基因团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形式过渡类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
PCR应用方面特异性RNA酶抑制剂
RNase Inhibitor/RNasin适用于有潜在RNase污染的地方, 在cDNA合成、体外转录系统、翻译系统保护mRNA。RNase Inhibitor是以可溶形式在大肠杆菌中表达纯化的重组RNase抑制剂，与存在于人胎盘中的特异性核糖核酸酶抑制剂具有相同的应用效果，其本质是分子量为50kDa的蛋白质。
RNasin可与多种RNA酶1：1 非共价结合，与RNA 酶快速形成复合物，使RNA酶失活。该蛋白质应置于一定浓度的二硫苏糖醇（DTT）和50％的甘油中，贮存于-20℃。其最大活性的发挥要求巯基试剂，而且它并不干扰反转录或mRNA在无细胞体系中的翻译。
武汉永利娱场城官网首页入口生产的RNase Inhibitor在广谱pH范围内，可与RNase A、B、C以 1:1 的比例高效非共价结合从而抑制这些酶的活性，对RNase 1、RNase T1、S1核酸酶、RNase H或来源于曲霉属的RNase无抑制作用。无核酸外切和内切 酶活性以及RNase污染。其与下列聚合酶共同使用时，RNase Inhibitor, Mammalian不会抑制聚合酶活性，如：Taq DNA聚合酶, AMV 或M-MuLV逆转录酶，噬菌体RNA聚合酶(SP6、T7或T3)等。
技术特点：
本项目研发了一种重组RNA酶抑制剂的高效可溶性表达与纯化的方法，并在此基础上建立了重组RNA酶抑制剂的生产工艺。与国内外竞品相比，蛋白产率和酶活更高。
单位定义：
抑制5ng RNase A活性的50%所需酶量为一单位。
产品特点：
广谱的RNase抑制活性：能够广泛抑制各种RNase A, RNase B, RNase C；
广泛的兼容性：与RT-PCR、qPCR系统兼容；抗氧化能力强；
超强热稳定性：适用于热稳定性逆转录酶，更高效的配合RNA逆转录
热灭活：65℃ ~10min；
RNase Inhibitor应用：
cDNA合成、逆转录PCR（RT-PCR）、微型RNA（miRNA）扩增
体外转录和翻译、RNA测序的目标mRNA保护、原位杂交、抗体制备、mRNA定位等
检测RNase Inhibitor产品性能：
荧光PCR法实验材料
测试组和对照RNase Inhibitor（40 U/μL）
RNase A
RNA样本
引物探针
反应缓冲液
MMLV逆转录酶、UDG酶
2×Taqman qPCR KIT
荧光PCR仪
实验方法与结果
1.gDNA去除反应
注：为避免RNA与RNase A接触提前发生降解，预先将RNase Inhibitor与RNase A按比例混合后再加入体系。
2.反转录反应体系
3.42℃，孵育15 min后，95℃，孵育3 min之后放于冰上。用2×Taqman qPCR KIT、扩增引物配置反应液，取5 μl cDNA进行荧光PCR检测。
检测结果：与同类产品效果对比，其效果明显优于同类产品
产品即到即用，无核酶污染，性能稳定，抑制明显。
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