如何快速优化PCR体系
浏览次数：89 日期：2023-09-08 14:22:40
PCR是分子生物学中常用的实验技术手段，在揭示生命现象规律方面发挥了至关重要的作用。目前在进行PCR实验操作时，因为PCR反应体系设计不合理而导致实验失败的事例较多。因此，从优化PCR反应体系的角度出发，对提高PCR反应效率进行探讨。
4、引物设计：
一、PCR反应体系：
一个常规PCR反应体系一般选用25～50 µ1体积，其中含有：
实际上，常规PCR体系通常含有：50mmol/L KCl（对于扩增大于500bp长度的DNA片段是有益的）、10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 3)、1.5mmol/L MgCl2。商品化的Taq DNA聚合酶时，一般均带有PCR缓冲溶液储存液，在设置PCR反应时，按PCR缓冲溶液的终浓度进行稀释。需要提醒的是MgCl2 , 有些公司提供的PCR缓冲液中已经含有适当浓度的MgCl2，此时无需在常规的PCR体系中另外添加；但是有些公司的PCR缓冲液中不含有Mg2+ 而是提供独立包装的MgCl2,以便使用者在设置PCR反应体系时，能够按照个性的实验设计要求来添加。
二、PCR体系优化：
1、Mg2+浓度：
镁离子（Mg2+）作为DNA聚合酶活性的辅助因子，有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键。此外， Mg2+能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷，从而促进引物与DNA模板形成复合物。
通常情况下，Mg2+以MgCl2的形式提供。但是，因硫酸盐在某些情况下有助于确保更稳定和可重现的性能，诸如Pfu DNA聚合酶等一些聚合酶首选MgSO4。由于镁离子能够与dNTP、引物、DNA模板和EDTA（如果存在）结合，因此，通常需要对镁离子浓度进行优化，以尽量提高PCR得率，并保持其扩增特异性。
在PCR中，标准的Mg2+终浓度范围为1~4 mM，建议优化滴定增量为0.5 mM。Mg2+浓度过低会降低聚合酶活性，导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面，Mg2+浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性，产生非特异性PCR产物，并增加由dNTP错误插入导致的复制错误。
2、退火温度：
一般低于Tm的5℃左右，退火温度太低会发生错配，可以通过梯度退火温度PCR仪来优化反应的退火温度，即在正式实验前，在确定了其他反应参数的情况下，按照实验的需要， 设置适当的梯度退火温度， 以0.5℃递增进行（如50.5、51.0、51.5…), 优化出最适退火温度。
3、促进剂：
在PCR体系中加入一些适当浓度的辅助物，如DMSO(二甲基亚砜）、PEG-6000 (聚乙二醇6000 )、甘油、 甲酰胺、非离子去污剂等，以降低碱基错配率或提供PCR的扩增效率。这些辅助物即为PCR促进剂。大多数的PCR促进剂在高浓度时会抑制PCR，因此在具体实验中，应根据PCR反应体系中特定的模板和引物的结合情况，选择PCR促进剂的最适浓度，但也会存在抑制。
4、引物设计：
需要花一整天来讨论的恐怕就是PCR引物的设计了，包括引物长度、GC含量、Tm值、二聚体等等……
在这里，我就简单地介绍优化引物浓度。如果添加过多的引物，会增加非特异性结合和引物二聚体。引物浓度推荐设定为0.2uM的较低水平效果会好很多。为了提高特异性，引物浓度甚至可以降到0.1uM，但是可能会减低PCR产量。
5、变性温度：
变性温度过高或变性时间过长都会导致DNA聚合酶活性的丧失，从而影响PCR产物的产量。变性温度过低或变性时间过短则会导致DNA模板变性不完全，使引物无法与模板结合同样会导致PCR反应的失败。通常情况下，95℃变性20～30秒即可使各种DNA分子完全变性。
6、延伸条件的优化：
延伸温度取决于所用的DNA聚合酶的最适温度，通常为70～75℃。延伸温度要求比较严格，一般不可随意更改。有时延伸温度相差1℃就可导致PCR反应的失败。延伸时间取决于扩增片段的长度。目的片段小500bp时，所需延伸时间为20秒；目的片段在500～1200bp时，延伸时间需40秒；目的片段大于1200bp时，则还需增加延伸时间。另外，还可以 500 bp/30秒为基准，根据目的片段的长度计算反应时间。目的片段小于150bp时可以省略延伸步骤，因为退火溫度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列的合成。
7、循环次数：
PCR反应的循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为25-35次，此时PCR产物的累积可达到最大值。随着循环次数的增加，一方面由于产物浓度过高，自身发生结合而不与引 物结合导致扩增效率的降低；另一方面，随着循环次数的增加，DNA聚合酶活性下降，引物与dNTP浓度也下降，会出现“平台效应”，也容易发生错误掺入，使非特异性产物增加。因此在得到足够产物的前提下应尽量减少循环次数。
8、热启动PCR：
将PCR反应混合物置于低千Tm值的温度下时，在极短的时间内即可产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。这种方法是在加入DNA聚合酶之前，先将PCR反应体系升温至95"C,预变性2～5分钟后，将仪器设在暂停，在这一高温条件下迅速加入DNA聚合酶后再恢复循环。热启动可以防止模板变性不充分，同时还避免了DNA聚合酶活性的迅速下降。
9、模板：
含有靶序列的模板DNA可以单链或双链形式加入PCR反应体系中。闭环DNA模板的扩增效率略低于线性DNA。尽管模板DNA的长短不是PCR扩增的关键因素，但当使用高分子量的DNA（＞10kb)作模板时，如用限制性内切酶先行消化（此酶不应切割其中的靶序列），则扩增效果更好。在PCR反应各项条件控制最佳时，仅单拷贝的靶序列作模板也能获得满意的结果，然而更多的情况是靶序列DNA的几千个拷贝数的模板量加人反应体系中。用哺乳动物基因组DNA作模板时，每个PCR反应所加入的模板约为1.0µg DNA, 它相当于常染色体单拷贝基因的约3*l05拷贝数的DNA量。酵母、细菌与质粒DNA作为PCR模板时，每个反应中典型的模板量依次是10 ng,1ng和lpg。
今天小编主要给大家分享了PCR实验优化的几点内容，希望能给读者贡献参考。
