数字PCR | 干货分享 | 芯片式数字PCR预混液上线啦！
浏览次数：25 日期：2023-10-07 11:26:17
dPCR即digital PCR（数字PCR），是一种基于泊松分布原理建立的核酸分子绝对定量技术。通过将待测样本进行极限稀释，使每个反应室中平均只有一个拷贝或者没有左右的目标DNA分子，然后加入荧光信号进行PCR扩增，可以检测到低至一个拷贝的突变。目前市面上的dPCR主要有两种形式——芯片式和液滴式，基本原理都是将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或油包水微滴中后经过PCR反应读取荧光信号。其中，芯片式数字PCR液滴更稳定、试剂兼容性和适配性更好，但技术壁垒较高。
dPCR原理图
通常样品的分配可以使用几种不同的方法来实现，包括微孔板、毛细管、油乳剂或带有核酸结合表面的小型化腔室阵列。样品分子的分散规律遵循泊松分布，根据其原理，反应体系中目标分子的拷贝数可以通过公式A=-ln[(N-X)/N]*N计算，从而精确定量目标分子存在于上样溶液中的浓度。
数字PCR优势
与常规PCR方法相比，数字PCR的优势：
①可以实现绝对定量：常规qPCR定量需要先制定已知拷贝数的标准曲线，但是由于待检样本与标准曲线不在同一体系，反应条件上会存在差异，另外加上PCR扩增效率的差异，从而会影响定量结果的准确性；而数字PCR不受标准曲线和扩增动力学影响，可进行绝对定量。
②样本需求量低：适用于珍贵样本或核酸降解严重的样本。
③灵敏度高：数字PCR是将传统PCR反应体系分割成数万个独立PCR反应，这些反应可以精确地检测很小的目的片段差异、单拷贝甚至低浓度的混杂样本，且能避免非同源异质双链的形成。
④高耐受性：由于目的序列被分配到多个独立反应体系中，显著降低了背景信号和抑制物对反应的干扰，扩增基质效应大大减小。
数字PCR发展
数字PCR技术产品经过十几年的发展，目前数字PCR在国内的临床分子检测已得以运用。目前市面上常用的国外dPCR品牌包括：
近年来，GIAGEN、Roche也陆续推出了数字PCR产品，均采用芯片式技术路线。
随着数字PCR的应用越来越广，国内数字PCR厂商也涌现出了10余家，数字PCR市场开始迸发活力!小海龟科技、新羿生物、锐讯生物等多家国内厂商相继推出各自的数字PCR系统：
国产数字PCR性能好、自动化程度高、使用成本低、应用技术更创新，大有赶超国外品牌的趋势。
2023年9月5日由北京市医疗器械检验研究院、中国食品药品检定研究院、北京市医疗器械审批检查中心等共同起草的《YY/T 1918-2023 数字聚合酶链反应分析系统》医疗器械行业标准已经审定通过，2024年9月15日开始实施。该标准适用于对核酸样本以单液滴或单核酸分子方式生成数百个至数百万个独立反应单元的设备，分析系统包括微液滴生成模块、聚合酶链反应模块和微滴检测模块等。
数字PCR耗材及试剂
数字PCR通用试剂主要包括：用于DNA检测系统的dPCR DNA聚合酶、数字PCR反应预混液；用于RNA检测系统的dPCR逆转录反应液、数字PCR一步法逆转录试剂盒等。
本公司重磅推出芯片式数字PCR预混液（货号CSB-DKT091），并在小海龟科技芯片式数字PCR平台上开展了重复验证，预混液适配性极好。该预混液为即用型预混液，用于液滴制备的前处理，其中含有HS Taq DNA Polymerase for dPCR（货号CSB-DKM090）和独特的PCR缓冲液，与用户自行准备的引物、探针混合在一起，构建PCR反应液，再用油相封闭在微流控芯片上的微反应腔室内，自动形成大小均一的微液滴使液滴稳定、扩增高效，同时最大程度保证扩增特异性。预混液与芯片式数字PCR系统配套使用，适用于探针法对DNA进行快速、灵敏的数字PCR检测。
· 芯片式数字PCR预混液（货号CSB-DKT091）性能表现
以下是在同一体系中采用探针法分型并经数字PCR分析的直方图和散点图，阳性信号和阴性信号可以轻松区分，背景干净。
一维直方图
一维散点图
二维散点图
以下是对不同浓度样本分析得到的一维散点图，可以检出约1 copies/uL浓度。
· 芯片式数字PCR一步法逆转录试剂盒（货号CSB-DKT094）性能表现
以下是本试剂盒与市面上的通用试剂盒及一步法dPCR试剂盒的对比，均采用相同的探针法分型，RNA模板一致。本试剂盒（CSB-DKT094）阳性信号浓度相比值更高，扩增效率更优。
一维散点图
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