辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体
浏览次数：128 日期：2023-10-20 17:02:02
HRP简介
1.HRP结构
辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase，简称 HRP，EC.1.11.1.7)。HRP广泛地分布于植物界，以辣根中含量最高。主要由糖蛋白（酶蛋白）和铁(III)原卟啉IX（辅基）组成，糖蛋白中糖含量一般是18~22%。糖由半乳糖、阿拉伯糖、木糖、岩藻糖、甘露糖、甘露糖胺和半乳糖胺组成，具体取决于特定同工酶。它由 300 个氨基酸和 4 个二硫键连接而成。相对分子质量约为44 000 道尔顿，包括多肽链（33 890道尔顿）、氯化血红素加Ca2+（约700道尔顿）和碳水化合物（约9 400道尔顿）。
2. HRP性质
由于辣根过氧化物酶的酶蛋白和辅基分别在最大吸收光谱为 275nm，辅基部分的最大吸收光谱为 403nm，二者比值 OD403/OD275 为酶的纯度。以 RZ 值(Reinheit Zabl 德文)表示。RZ＞3 为高质量，RZ＞2.5 为中等质量，RZ＜2.5 则需要纯化。
HRP 易溶于水，溶解度为5%(W/V)，溶液呈棕红色，透明。
等电点 5.5～9.0 之间，辣根过氧化物酶同工酶的等电点范围为3.0-9.0。它催化的最适 pH 因供氢体不同而有所差异，但多在 pH5.0 左右。
HRP易与过氧化氢（H2O2）结合，而所得的[HRP-H2O2]络合物可氧化各种氢供体。HRP可以通过几种不同的方法与抗体结合，包括戊二醛，高碘酸盐氧化，通过二硫键，以及通过氨基和巯基定向交联剂。它比酶标记β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶更小且更稳定，因此是最理想的标记。此外，它的糖基化会导致更低低的非特异性结合。
当与底物一起孵育时，辣根过氧化物酶可产生标记分子的有色、荧光或发光衍生物，从而可实现定量。
3. HRP常见底物
① 显色底物
备注：TMB因其灵敏度高及无致癌性而得到广泛应用。
② 发光底物
HRP标记抗体的免疫反应常用底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧存在下，生成激发态中间体，当其回到基态时发光，波长425nm。（在发光过程中不需要消耗HRP，HRP只是其催化作用）
HRP的标记
HRP标记抗体的方法主要推荐戊二醛和高碘酸钠氧化法。科赛格研发部门使用的HRP标记方法是改良过的高碘酸钠氧化法，下面介绍一下这种方法：
1. 抗体的处理
如果原抗体中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂，需要透析处理抗体。
2. HRP氧化反应（活化）
称量一定量 HRP溶于醋酸盐缓冲溶液中，配制高碘酸钠溶液，现配现用，跟HRP按合适比例混合，4℃避光静置反应30min，此时溶液为墨绿色。
3. 终止氧化
加一定量终止液于氧化好的HRP中（缓慢搅拌）。25℃避光静置反应30min，此时溶液为黄褐色。
4. 抗体的标记
将终止氧化的HRP溶液直接加入到透析好的抗体中混匀，25℃避光反应1-4小时。
5. 终止标记
称取一定量的NaHB4（现配现用），加入上述反应液中，25℃室温避光反应1-2小时。
6.纯化保存
20 mM PBS（pH=7.4）4℃避光透析过夜，中途换液两次。然后在标记液中加入等体积的甘油，混匀后-20℃保存。
