哺乳表达系统-转染全流程介绍
浏览次数：14 日期：2023-10-26 17:12:50
哺乳动物细胞是表达人类基因比较理想的系统，其优点是能够促进蛋白质正确折叠，提供准确的糖基化、乙酰化等多种翻译后修饰。它能通过构建信号肽使成熟的蛋白分泌到胞外，利用亲和纯化的方式，比较轻松地获得高活性的蛋白。基于哺乳动物细胞表达系统制备的重组蛋白，其高级结构、翻译后修饰、理化性质、生物化学活性更接近天然的高等生物蛋白质分子，被大量用于治疗性重组蛋白的生产。华美科赛格建立了成熟的哺乳动物蛋白表达系统及纯化服务平台，提供哺乳动物蛋白表达系统的表达与纯化服务。
然而，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据您的细胞类型和实验需要进行选择，理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和可重复性等特点。现在哺乳表达平台普遍使用的是化学转染法，下面就以阳离子聚合物的化学转染方法为例来介绍。
转染概述
转染，顾名思义，是指将某种物质转移到细胞内。在生物医学研究中，这个“物质”通常指的是DNA或RNA。转染的目的是产生重组蛋白，或特异性增强或抑制转染细胞中的基因表达。转染是分子生物学和细胞生物学研究的重要技术，它允许我们向细胞引入外源基因，从而进行基因功能研究、基因表达调控，或是进行基因治疗等。本文将详细介绍转染的概念、类型、转染方式及步骤和注意事项等方面来介绍此技术。
转染类型
根据导入的核酸存在于宿主细胞的时间长短，可以分为瞬时转染和稳定转染。
瞬转：指外源基因进入受体细胞后，存在于游离的载体上，不整合在细胞的染色体上。该方法是通过一定的转染程序将含目的调控区的质粒导入培养细胞。此时质粒仍然以附加的形式存在，很少整合进宿主基因组。因此，mRNA或蛋白质产物必须在短时间内进行测定，否则随着细胞的生长和分裂，质粒会被降解或稀释。
稳转：外源DNA整合到细胞基因组中或作为附加体质粒保留在细胞中。与瞬时转染不同，稳定转染允许外源DNA在转染的细胞及其后代中的长期维持。然而，通常是将单拷贝或几个拷贝的外源DNA整合到稳定转染的细胞的基因组中，因此，其表达水平一般低于瞬时转染的表达水平。
两种方法对比如下表：
转染方式
细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也带负电荷。为了使核酸穿过细胞膜，研究人员开发了多种技术，大致分为三类：化学方法---利用载体分子包被核酸使其呈现中性电荷或正电荷。生物方法---利用基因工程病毒转染非病毒基因到细胞中。物理方法---在细胞膜表面产生一个瞬时的孔从而导入DNA。
各方法优缺点如下表：
然而，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据您的细胞类型和实验需要进行选择，理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和可重复性等特点。现在哺乳表达平台普遍使用的是化学转染法，下面就以阳离子聚合物的化学转染方法为例来介绍。
阳离子聚合物转染法
阳离子聚合物（如PEI）是一种相对安全、高效的基因载体，其结构上的一个共同特点是分子内含有许多氨基，在生理pH下会发生质子化，这些质子化的氨基可以中和 DNA 质粒表面的负电荷，使DNA分子由伸展结构压缩为体积相对较小的DNA粒子，或将目的基因包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解，因此它们可以作为基因载体。
阳离子聚合物表面的正电荷与DNA上带负电荷的磷酸基团产生静电作用形成阳离子聚合物-DNA复合物。阳离子聚合物-DNA复合物主要是通过细胞内吞作用将DNA转移进入细胞，形成内含体，DNA从内含体释放，进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。该方法具有适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小且转染效率高等诸多优点。它适用于多种贴壁或悬浮细胞的质粒DNA转染。
阳离子聚合物转染实验流程一般包括：细胞准备与接种、转染试剂的稀释、核酸的稀释、转染复合物的制备、转染复合物加入细胞中、转染结果分析等步骤。
1. 细胞的准备：使用形态正常，活率最好在95%以上的健康细胞，确保细胞没有被细菌、真菌或支原体污染。如果细胞是近期复苏的细胞，需要在转染前传代3-4次在细胞瞬时转染前需确定其细胞密度及存活率。为确保转染效果，建议使用处于对数生长期内（密度约为2×106cells/ml）的细胞转染。最好不要在培养基中添加抗生素，对于一些敏感细胞，抗生素的存在会引起细胞毒性。
2. 转染试剂的稀释：需要进行优化，可以固定核酸的量，设置转染试剂的梯度，建议转染试剂和DNA的比例在1:1~1:8，稀释时动作要轻柔，避免剧烈吹打和涡旋。
3. 核酸的稀释：对于质粒DNA，需要使用高纯度、无菌、无内毒素的高质量DNA（建议用无内毒素质粒DNA提取试剂盒抽提质粒），也可以建立梯度摸索最佳投入量，同样稀释时动作要轻柔，避免剧烈吹打和涡旋。
4. 转染复合物的制备：转染试剂的加样顺序推荐为稀释后的核酸加入到稀释后的转染试剂中，转染复合物的孵育时间按照说明书设置，一般10min左右。
5. 转染复合物滴加入细胞中：转染复合物缓慢加入细胞液，并及时充分混匀，避免培养基局部转染试剂浓度过高。
6. 结果分析：对于目的蛋白的检测，常常用到WB检测，若转染的质粒表达荧光蛋白可以使用荧光显微镜观察或流式细胞仪分析转染效率。
悬浮细胞瞬转过程如下图：
总之，转染实验流程看似不复杂，但过程中有很多细节需要特别注意，一不留神可能满盘皆输。
